用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
2020-01-14

用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术

本发明提供,并且在某些具体但非限制性的方面中涉及:测定法,所述测定法可以用于预测给定的ISV是否遭受如本文所述的蛋白干扰和/或在所述测定法(如例如在ADA免疫测定法)中产生(非特异性)信号。所述预测性测定法可以例如用于测试给定的ISV是否可能具有产生所述蛋白干扰和/或所述信号的倾向;用于选择不易遭受或较不容易遭受所述蛋白干扰或产生所述信号的ISV’s;作为这样的测定法或测试,其可以用于测试对ISV的某些修饰是否(完全或部分)减少其产生这样的干扰或这样的信号的倾向;和/或作为这样的测定法或测试,其可以用于指导ISV的修饰或改进从而减少其产生所述蛋白干扰或信号的倾向;‑方法,所述方法用于修饰和/或改进ISV’s从而消除或减少其产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向;‑可以引入ISV的修饰,其消除或减少所述ISV产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向;‑被特异性选择(例如,使用本文所述的测定法)从而不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向的ISV’s;‑被修饰和/或改进的ISV’s,其不具有或具有较低/减小的产生所述蛋白干扰或所述信号的倾向。

此外,不限于任何具体假说或解释,上述数据显示ISV的C-端区(如本文定义)的(各种)取代可以改变/改善其产生蛋白干扰的倾向。

回到本发明所用的分析抗体,其优选地是这样的(多克隆或单克隆)抗体,其识别ISV的C-端区(如上定义),并且具体地,但不限于识别纳米抗体的C-端区。

所用测定法是基于ECL(电致化学发光)的桥接测定法,其使用生物素化的ISV(SEQIDNO:1的生物素化的变体)进行捕获和使用磺基(sulfo)-标记的ISV检测抗-药物抗体。类似的形式也用于进行ADA测定法。使用磺基-NHS-LC-生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Pierce)和磺基-标记NHS-酯(Sulfo-tagNHS-Ester)(MSD),分别按照生产商的说明书,使用在伯胺上进行的标准偶联化学来进行ISV的生物素化和磺基-标记。将血浆样品在PBS/0.1%酪蛋白中稀释1/5并且在96孔聚丙烯板中在37°C,600RPM温育30分钟。接着,将样品(50yL)在2yg/ml生物素化和2yg/ml磺基-标记的ISV(SEQIDNO:1)的1:1混合物(100μL)中稀释1/3,并在室温,600RPM温育1小时。在室温将MSDMA1196-孔标准链霉抗生物素蛋白板用150yL/孔SuperblockuiΤ20封闭1小时,接着用PBS/0.05%Tween20(=洗涤缓冲液)洗涤3次。将样品/1:1混合物(生物素化和磺基-标记ISV(SEQIDN0:1)(50.OyL)从聚丙烯板转移到MSD板并且在室温,600rpm温育1小时。将板洗涤3次,之后加入2x读取缓冲液(MSD)(150yL/孔)并在MSD仪器(SectorImager2400阅读器)上阅读ECL单位(ECLU)。使用在方法验证过程中确定的筛选截点将样品筛选为阳性或阴性。使用如关于ADA测定法开发的指导(Shankar,2008)所推荐的适合统计学分析,基于118个来自从未用ISV处理的健康个体的单个血浆样品的背景值计算筛选截点。使用非参数的评估并且在排除异常值后,基于95th百分数计算截断值。

还应该注意,本发明不具体限于任何关于在本发明中观察到或根据本发明可以被减少的蛋白干扰(和/或在免疫测定法中产生的信号)的任何起因,解释,假说或机制。然而,认为某些个体或个体群体的血液或血清(或其他生物流体,如本文提及的那些)可以包含某些(预先存在)的蛋白,其在某些情形下可以(非特异性地)结合于ISV’s,导致在某些测定法(其用于分析获自所述个体的血液或血清样品)中的干扰信号。这特别基于在产生本发明中所做的观察,即由本发明所解决的非特异性蛋白干扰不仅在测定获自预先施用了ISV的受试者的样品时存在,而且在测定获自预先未接受ISV的受试者中获得的样品时也会存在。

此外,如本文进一步所述,本发明教导技术人员许多这样的方法,其中可以修饰或改进ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物从而减少或避免它们产生蛋白干扰的倾向。因此本发明通常还获得了具有减少的、较低的或不具有任何产生蛋白干扰倾向的修饰和/或改进的ISV、纳米抗体、基于ISV的药物或基于纳米抗体的药物。

本实施例与下述实施例9一起证实单克隆21-4与ISV的结合可用于预测(在本实施例指定的确定性的程度内)给定的ISV是否具有遭受非特异性蛋白干扰的倾向(例如在ADA测定法中)。

C.与其他ISV’s的非特异性结合

本实施例与下述实施例9一起证实单克隆21-4与ISV的结合可用于预测(在本实施例指定的确定性的程度内)给定的ISV是否具有遭受非特异性蛋白干扰的倾向(例如在ADA测定法中)。

备选地,所述B-细胞可以使用本身已知的B-细胞扩增技术进行扩增,并且所述一种抗体/多种抗体可以从所述扩增的B-细胞的(培养物上清液)分离。此外,这可以使用本领域中充分建立和在各种书籍和手册中描述的和此外,在前述段落中提及的专利出版物中描述和/或提及的适合技术进行。

-图2示意性显示ISV、诸如纳米抗体的代表性3D结构。

-n=l,2或3,其中每个X=Ala或Gly;或

所述方法可以具体地使用BiaCore或类似技术进行,和更具体地使用在实施例9中提出的方案进行。如本文提及,当ISV或基于ISV的药物在该方案中的结合显示少于500的RU值时(在根据公式/XlO6,关于蛋白的分子量调整测量的RU值后),所述ISV或基于ISV的蛋白不可能与在人的血液或血清中存在的任何干扰因子结合和/或不可能具有在ADA测定法中遭受非特异性蛋白干扰的倾向(即在下面的实验部分中提出的置信度内)。

(g)VTVSS⑻n,其中n=l并且X=Gly;